定量PCR實驗技術(shù)分享1
更新時間：2017-08-02 瀏覽次數(shù)：4236
1. 如果擴增曲線ct值比較靠后的話，32左右，一般有什么方法解決沒有
ct值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經(jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴增效率我們認(rèn)為是確定的一個值）。因此能夠把ct值往前移。
解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。
2. 為什么合成的引物做不加摸板的對照也能擴增出目的條帶，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?
引物被污染。
3. 實時定量PCR，熒光定量PCR，實時熒光定量PCR，real－time PCR，這些是不是同一個概念
是一個概念。
4. 我的標(biāo)準(zhǔn)曲線的slope總是大于４，而且每個梯度的平行ct值差別比較大，原因？
這個斜率是＝1/LOG 10(擴增效率)，理論上擴增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，說明擴增效率比較小?？梢钥疾橐幌路磻?yīng)體系是否合理？酶活是否正常？
平行管的CT值差別大可以考查一下自己實驗操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會導(dǎo)致CT值差別比較大。
當(dāng)斜率為4的時候，擴增效率是77.8%，斜率大于4的話，效率繼續(xù)下降。
擴增效率的問題實際就是引物的擴增效率，可能酶活的關(guān)系沒有那么重要，前提是試劑盒的質(zhì)量有保證?；氐綌U增效率，只有在引物和模板處于zui適比例時才能得到比較滿意的擴增效率，因此通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。
5. ROX染料是什么作用？
ROX的作用ABI宣稱是用來校準(zhǔn)加樣誤差的。
但是據(jù)說ROX的作用實際上是用來校準(zhǔn)光程差的。即每個孔的熒光信號經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到CCD的時候，走過的光程是不一樣的，這樣在CCD上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個差異用ROX來計算孔間差異有多大，然后差異系數(shù)去處理，實際的熒光信號。具體過程我不是非常清楚，請高手指正。
6. 熒光定量PCR的基線，是怎么確定的呢？
基線就是背景值，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個地方可以輸入baseline從第幾到第幾cycle作為基線。設(shè)置原則是使沒有起跳之前zui多的cycle的信號接近0。
7. 我剛準(zhǔn)備做定量，請教一下，不知道伯樂的機子怎么樣？請推薦幾個合適的ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ的盒子，１０００以內(nèi)的（沒錢不好辦?。?，我大約做２０個樣。現(xiàn)在對ＳＹＢＲ?。牵遥牛牛握J(rèn)可嗎？
伯樂的機子不錯。takara的試劑盒，大概在1500元，400個反應(yīng)。大部分人做還是用sybr green I的。這是zui常用的染料。