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專題：轉(zhuǎn)染（transfection）--轉(zhuǎn)染試劑的選擇

更新時(shí)間：2013-07-08 瀏覽次數(shù)：2060

下面我們?yōu)榇蠹姨峁┮恍┏Ｓ弥|(zhì)體試劑的適用細(xì)胞系信息以及轉(zhuǎn)染FAQs：
 
1.  promega公司
 
Promega轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品適合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉(cāng)鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲(chóng)S19等等細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。詳情請(qǐng)參閱http：//www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm
 
2.  Invitrogen公司
 
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，我公司推薦您使用Invitrogen公司生產(chǎn)的lipofetamine2000試劑盒。適合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各種常用細(xì)胞系的RNAi轉(zhuǎn)染。詳情請(qǐng)參閱http：//invitrogen.com/content.cfm?pageid=4547%20
 
3.  轉(zhuǎn)染FAQs：
 
針對(duì)同種陽(yáng)離子脂質(zhì)體的疑難解答
 
Q1：轉(zhuǎn)染效率低
 
A1：
（1）沒(méi)有使用優(yōu)化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。解決建議：選擇針對(duì)您的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染效率可能zui高的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。參見(jiàn)附錄A或（www.invitrogen.com）上“Transfection Collection”中的參考文獻(xiàn)列表。
（2）沒(méi)有使用優(yōu)化條件。解決建議：優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。參見(jiàn)第7章優(yōu)化步驟。參見(jiàn)（www.invitrogen.com在Tech-online分子生物學(xué)部分）上的細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)染步驟。
（3）DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。解決建議：在復(fù)合體形成時(shí)不要使用血清。OPTI-MEM I培養(yǎng)基和DMEM是用于復(fù)合體形成的較好的培養(yǎng)基。如果使用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，保證在無(wú)血清條件形成復(fù)合物。注意：不要將OPTI-MEM I培養(yǎng)基用于LIPOFECTAMINE PLUS試劑或昆蟲(chóng)細(xì)胞。對(duì)于Sf9和Sf21細(xì)胞，Sf-900Ⅱ SFM會(huì)得到*結(jié)果。
（4）存在抑制劑。解決建議：不要在用于制備DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。
（5）不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。解決建議：細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度為70%~90%。
（6）轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子沒(méi)有被宿主細(xì)胞識(shí)別。解決建議： 確保轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子同目的細(xì)胞類型兼容。
（7）陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。 解決建議：不要使用凍結(jié)的或儲(chǔ)存溫度低于4℃的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。
（8）轉(zhuǎn)染分析的問(wèn)題。解決建議： 轉(zhuǎn)染分析中加入陽(yáng)性對(duì)照。
（9）質(zhì)粒純化的問(wèn)題。解決建議： 請(qǐng)核對(duì)是否使用轉(zhuǎn)染級(jí)的質(zhì)粒純化試劑盒。通常轉(zhuǎn)染級(jí)的質(zhì)粒純化試劑盒使用DEAE樹(shù)脂而非硅樹(shù)脂，并且是用重力流動(dòng)（過(guò)濾）的方法而不是離心技術(shù)，因?yàn)闃?shù)脂帶來(lái)的污染會(huì)導(dǎo)致較高的內(nèi)毒素。另一種方法（可用于任何級(jí)別的純化試劑盒），是在zui后一步從樹(shù)脂柱上洗脫質(zhì)粒后，將溶液置于55℃的水浴上保溫5分鐘。zui后小心地從上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。這是減少樹(shù)脂的交叉污染的方法。
 
 
Q2：細(xì)胞死亡率高。
 
A2：
（1）DNA量太高。 解決建議：作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定*的DNA量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，因?yàn)閱为?dú)DNA也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響。參見(jiàn)第7章微調(diào)/優(yōu)化方法。
（2）陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量太高。解決建議： 作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定*的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入DNA，因?yàn)閱为?dú)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑也只對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響。參見(jiàn)第7章微調(diào)/優(yōu)化方法。
（3）在轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用抗菌素。 解決建議：在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因?yàn)殛?yáng)離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。
（4）細(xì)胞太少。 解決建議：作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定每個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中*的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)您的應(yīng)用所要求的效率調(diào)整細(xì)胞數(shù)量。
（5）在無(wú)血清條件下細(xì)胞活性降低。 解決建議：使用OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基。降低或省去在無(wú)血清培養(yǎng)基中清洗的次數(shù)。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用5%到10%的血清。確保在不存在血清的條件下形成復(fù)合物。
（6）陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑氧化了。 解決建議：不要過(guò)分?jǐn)噭?dòng)或振蕩陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑；這可能會(huì)形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的過(guò)氧化物。
（7）對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快。解決建議： 在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留48小時(shí)使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。
 
Q3：陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑-DNA復(fù)合物沉淀。注意：在顯微靜下可以在細(xì)胞上觀察到小的顆粒狀顆粒沉淀。這是正常的。此沉淀是否存在并不表明轉(zhuǎn)染效率的高低。
 
A3：
（1）存在過(guò)剩的EDTA。 解決建議：使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用濃度<0.3mM的EDTA溶液稀釋DNA。
（2）DNA或陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑濃度過(guò)高。解決建議： 確保陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的濃度不要超過(guò)復(fù)合物形成的建議量（參見(jiàn)表5）。
 
Q4： 轉(zhuǎn)染重復(fù)性不好。
 
A4：
（1） 轉(zhuǎn)染時(shí)的融合度波動(dòng)。 解決建議：在不同的轉(zhuǎn)染時(shí)報(bào)持所有的轉(zhuǎn)染參數(shù)恒定，如融合度，傳代次數(shù)和生長(zhǎng)時(shí)相等。
（2）在培養(yǎng)中細(xì)胞發(fā)生變化。解決建議： 如果可能，使用來(lái)源于經(jīng)選擇轉(zhuǎn)染效率較高亞系的細(xì)胞。如果可能，融化新鮮細(xì)胞。
 
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